Позвоните нам, если появились вопросы

8-800-100-28-84

(бесплатно для звонков по РФ)

+7 (495) 664-28-84

Цифровое секвенирование ДНК (Digital NGS)

QIAseq Targeted RNAscan Panel.jpg


Панели серии QIAseq Targeted DNA Panels являются одним из решений компании QIAGEN «от Образца к Результату» для цифрового секвенирования с использованием молекулярного баркодирования. Цифровое секвенирование ДНК – уникальный подход для детекции низкочастотных вариантов, который позволяет получить достоверные результаты путем избавления от ПЦР-дубликатов, ложноположительных результатов и биаса.

  • Благодаря молекулярному баркодированию цифровое секвенирование позволяет удалять ПЦР-дубликаты;
  • Панели адаптированы для работы с фрагментированной ДНК (FFPE, свободно циркулирующая ДНК);
  • Для работы требуется минимальное количество ДНК, позволяя сохранять ценные образцы;
  • Оптимизированные реагенты и протокол анализа обеспечивают высокие показатели покрытия GC-богатых регионов.

Концепция молекулярного баркодирования заключается в том, что каждая оригинальная молекула-мишень «помечается» уникальной последовательностью «штрих-кода» перед этапом амплификации. Это достигается путем лигирования двойной цепи кДНК мишени с таким «штрих-кодом» или индексом, содержащим 12-нуклеотидную случайную последовательность (например, TATCGTACAGAT). Статистически, такая последовательность обеспечивает 412 = 16 777 216 уникальных комбинаций для каждого баркода и, таким образом, каждая цепь кДНК в образце получает уникальную последовательность.

Каждая панель QIAseq Targeted DNA Panel является универсальным решением для всех платформ NGS и содержит в своем составе все необходимые компоненты для обогащения целевых генов и создания библиотек ДНК. Наборы содержат специфические единственные праймеры для обогащения интересующих участков, что позволяет уменьшить общее количество праймеров. Все праймеры собраны в индивидуальные пулы для того, чтобы сократить число манипуляций и количество пулов при работе с панелями. Платформ-специфичные индексы позволяют секвенировать до 384 образцов за один запуск прибора.

Особенности

  • Точность: инновационная технология цифрового секвенирования (встраивание молекулярных штрих-кодов) решает проблему ПЦР-дубликатов и исключает артефакты амплификации, а также позволяет детектировать низкочастотные варианты с высокой точностью (см. Принцип молекулярного баркодирования).
  • Специфичность: уникальное сочетание запатентованного алгоритма создания праймеров и тщательного тестирования каждого праймера гарантирует высокую специфичность и точные результаты NGS.
  • Равномерность: панели серии QIAseq Targeted DNA Panel оптимизированы для обеспечения высокой однородности секвенирования целевых участков (см. Равномерность).
  • Чувствительность: цифровое секвенирование ДНК оптимизировано для получения достоверных результатов при анализе низкочастотных вариантов.
  • Универсальность: протокол пробоподготовки и компоненты наборов QIAseq Targeted DNA Panels совместимы для работы с такими участками генома, как регуляторные и GC-богатые регионы, и обеспечивают их 100% покрытие (см. Покрытие GC-богатых регионов).
  • Гибкость: панели разработаны для широкого спектра применения. Кроме того, имеется возможность создавать пользовательские «custom» панели или расширить содержание уже существующих панелей. Использование индексов QIAseq позволяет проводить мультиплексный анализ до 384 образцов за запуск прибора.

Принцип работы

ПЦР-дубликаты являются основной проблемой при целевом секвенировании ДНК, так как после амплификации уникальные молекулы ДНК превращаются в идентичные ампликоны, которые часто не могут быть различимы друг от друга. Кроме того, ошибки ПЦР могут присутствовать в окончательных результатах секвенирования, что может привести к возникновению ложноположительных результатов секвенирования. Это, в свою очередь, приводит к невозможности точно детектировать варианты, частота которых изначально была низкая. Панели серии QIAseq Targeted DNA Panels используют цифровое секвенирование со встраиванием молекулярных штрих-кодов в исходную ДНК до проведения этапа амплификации, тем самым сохраняя уникальность исходных молекул ДНК и избегая возникновения ПЦР-дубликатов, ложноположительных результатов и биаса.

Схема рабочего процесса

Рабочий процесс от выделения ДНК до получения готовых библиотек при использовании панелей QIAseq Targeted DNA Panels составляет не более 9 часов (рис. 1). Выделенная геномная ДНК (от 20 нг) ферментативно расщепляется с целью получения небольших фрагментов двухцепочечной ДНК. После этого следует этап создания библиотек, при котором адаптеры IL-N7, молекулярные штрих-коды и индексы для мультиплексного анализа встраиваются во фрагменты ДНК, полученные на предыдущем этапе. Такие фрагменты ДНК служат матрицей для последующего целевого обогащения с использованием одного ген-специфичного праймера и прямого универсального праймера. Таким образом, заключительный этап пробоподготовки заключается в амплификации библиотек и индексирования образцов (двойное индексирование) с использованием IL-S5 праймера с индексом и универсального праймера.

Файлы с данными секвенирования могут быть загружены в специально разработанный бесплатный облачный сервис QIAseq, который фильтрует, собирает и выравнивает риды, а также подсчитывает уникальные молекулярные баркоды, связанные с целевыми участками, а также меченные последовательности. После такой обработки данные анализа могут быть проанализированы с использованием программного обеспечения Ingenuity Variant Analysis или QCI Interpret

Cхема молекулярного баркодирования.jpg

Рисунок 1. Схема рабочего процесса при использовании панели QIAseq Targeted DNA Panel.

Покрытие GC-богатых участков генома

Панели серии QIAseq DNA Targeted Panels содержат уникальные реагенты для эффективного секвенирования GC-богатых участков. На рисунке 2 показаны примеры анализа генов CEBPA и CCND1. Данные демонстрируют, что достигается полное покрытие экзонов для представленных генов. 

Покрытие gc регионов

Рисунок 2. Анализ покрытия GC-регионов при использовании панели QIAseq DNA Targeted Panel.

Принцип молекулярного баркодирования

Ложноположительные варианты могут появляться на каждом этапе рабочего процесса, включая процесс секвенирования, что приводит к невозможности достоверно определять низкокопийные варианты (с частотой встречаемости 1%). ПЦР-дубликаты возникают на этапе амплификации, когда все молекулы ДНК выглядят практически одинаково и нет возможности определить, является ли специфический фрагмент ДНК уникальным или дубликатом молекулы ДНК. Благодаря молекулярному баркодированию каждая уникальная молекула ДНК кодируется до этапа амплификации, что позволяет определить молекулу ДНК по уникальному штрих-коду и удалить в процессе обработки данных ПЦР-дубликаты с таким же штрих-кодом. Такой подход в значительной степени повышает чувствительность и точность NGS анализа.

Принцип молекулярного баркодирования

Рисунок 3. Принцип молекулярного баркодирования.

Равномерность покрытия

Панели QIAseq Targeted DNA Panel обеспечивают высокие показатели секвенирования. В частности, было проведено исследование, в котором было использовано в качестве образца 20 нг ДНК NA12878 и были проанализированы 6 000 SNP. Секвенирование проводилось с использованием прибора MiSeq с генерацией 4 000 000 чтений. При этом однородность покрытия составила 99,5% при среднем покрытии 0.2х, и 96% при среднем покрытии 0.5x (Рис. 4).

Покрытие для QIAseq Targeted DNA Panel

Рисунок 4. Показатели покрытия при использовании панели QIAseq Targeted DNA Panel.

Применение

Панели серии QIAseq Targeted DNA Panel могут быть использованы для анализа ДНК, полученной из широкого спектра образцов, и различных областей применения.

Панели подходят для исследования:

  • SNV;
  • небольших инсерций/делеций (indels);
  • анализ CNV.

Панели серии QIAseq Targeted DNA Panel адаптированы для работы со следующими типами образцов:

  • FFPE;
  • плазма/сыворотка;
  • свежая или замороженная ткань;
  • клеточные линии.

Области применения:

  • исследование ДНК солидных и гематологических опухолей;
  • детекция «Hotspot» в солидных опухолях;
  • исследование вариантов в митохондриальной ДНК;
  • ADME-фармакогеномика;
  • идентификация личности и определение родства;
  • оценка герминогенных мутаций при наследственных заболеваниях;
  • исследование экзомов генов BRCA1 и BRCA2.

Подробнее о наборах серии QIAseq Targeted DNA Panels на сайте QIAGEN:

https://www.qiagen.com/ru

Задать вопрос

   
CAPTCHA
*Введите код с картинки:


* - поля, обязательные для заполнения.