Позвоните нам, если появились вопросы

8-800-100-28-84

(бесплатно для звонков по РФ)

+7 (495) 664-28-84

Анализ транскриптома одиночных клеток

pic single cell

Компанией QIAGEN разработаны наборы реагентов для амплификации суммарной РНК и мРНК одиночных клеток:

  • Полнотранскриптомный анализ одиночных клеток
  • Амплификация суммарной РНК и поли-А обогащенной мРНК
  • Оптимизировано для использования с новыми технологиями, включая NGS
  • Инновационное решение для исследований рака и стволовых клеток

Набор реагентов REPLI-g WTA Single Cell обеспечивает надежный анализ регуляции транскрипции на уровне одиночных клеток и позволяет равномерно амплифицировать все транскрипты из одиночных клеток (1-1000 клеток). Входящие в состав буферы и реагенты подвергаются уникальной, контролируемой процедуре деконтаминации методом Repli-g для блокировки контаминации чужеродными нуклеиновыми кислотами. Инновационный компонент, буфер для лизиса, эффективно стабилизирует клеточную РНК, обеспечивая точное отображение профиля экспрессии генов полученного образца РНК. Все этапы ферментативной обработки разработаны специально для обеспечения эффективной обработки РНК и точной амплификации кДНК, которая достигается благодаря ничтожно малому изменению последовательности при использовании инновационной технологии – амплификации с множественным вытеснением цепи (Multiple Displacement Amplification, MDA).

Доступны следующие варианты наборов:

  • REPLI-g WTA Single Cell Kit (24), кат. номер 150063
  • REPLI-g WTA Single Cell Kit (96), кат. номер 150065

Характеристики наборов REPLI-g WTA Single Cell

Полное покрытие транскриптома с низкой вариабельностью результатов эксперимента

Набор REPLI-g WTA Single Cell содержит новую ДНК полимеразу SensiPhi, а также оптимизированный набор буферов и реагентов для полнотранскриптомной амплификации РНК из единичных клеток, 1000 клеток, либо эквивалентных образцов. Вслед за эффективным лизисом, полным удалением геномной ДНК и высокочувствительной обратной транскрипцией, с помощью набора проводится амплификация с множественным вытеснением цепи (MDA). Такой подход позволяет обеспечить однородную амплификацию кДНК всего транскриптома с незначительным уровнем ошибок копирования последовательностей. Амплифицированная таким образом кДНК демонстрирует высокую воспроизводимость от клетки к клетке и от эксперимента к эксперименту, при анализе специфических транскриптов как методом NGS, так методом ПЦР в реальном времени. Амплифицированная кДНК может быть легко использована для различных типов исследований.

Большое количество прочтений картируется на белок-кодирующие РНК

Возможность амплифицировать фракцию РНК, обогащенную мРНК (poly A+) делает набор REPLI-g WTA Single Cell особенно удобным для использования в NGS при исследовании регуляции транскрипции на уровне транскриптома одиночных клеток. Амплификация рибосомальной РНК (рРНК), которая составляет более 90% прочтений при NGS, практически исключена, что позволяет получать значимые данные секвенирования о мРНК. После полнотранскриптомной амплификации с использованием протокола обогащения мРНК, доля прочтений белок-кодирующих РНК превышает 80%.

Надежное обнаружение низкокопийных транскриптов

Анализ одиночных клеток может быть осложнен, когда копийность транскриптов сильно варьирует внутри клетки. Для получения достоверных результатов необходимо, чтобы точно амплифицировались все транскрипты, независимо от их копийности. Набор REPLI-g WTA Single Cell подходит для анализа даже низкокопийных транскриптов. Анализ методом ПЦР в режиме реального времени транскрипта abl-1, амплифицированного REPLI-g, показывает, что даже низкокопийные транскрипты могут быть успешно обнаружены, при использовании данного набора. В отличие от решений других производителей, набор REPLI-g WTA Single Cell WTA позволяет с высокой чувствительностью обнаруживать все транскрипты: как высоко-, так и низкокопийные.

Использование для широкого спектра исследований

С помощью набора REPLI-g WTA Single Cell Kit можно эффективно синтезировать и амплифицировать кДНК из одиночных клеток, таких как опухолевые клетки, стволовые или отсортированные клетки, а также из очищенной суммарной или поли А+ РНК (10 нг – 100 нг), что делает данный набор применимым для широкого набора исследовательских задач:

  • исследование биомаркеров (экспрессия);
  • исследование стволовых клеток;
  • анализ циркулирующих фетальных клеток;
  • изучение мозаицизма;
  • изучение генетической предрасположенности;
  • типирование трансгенных животных;
  • анализ соматических вариаций генома;
  • изучение прогрессирования опухолевого процесса;
  • анализ циркулирующих опухолевых клеток.

Принцип работы

На регуляцию транскрипции влияют различные факторы, такие как стресс, клеточное окружение, заболевания или соматических геномные отклонения (например, точечные мутации, вариации числа копий генов (CNV) или структурные изменения). Кроме того, посттранскрипционный процессинг, как, например, альтернативный сплайсинг, приводит к дифференциальному профилю экспрессии и, в конечном счете, к различным физиологическим процессам. Из-за сложной структуры тканей интерес к изучению регуляции транскрипции в одиночных клетках растет в большей степени, чем к анализу большего числа клеток и интерпретации результатов их усредненного поведения.

Набор реагентов REPLI-g WTA Single Cell Kit был специально разработан для надежного изучения регуляции транскрипции на уровне одиночных клеток. Он представляет высоко унифицированную систему амплификации всего транскриптома с пренебрежимо малой ошибкой копирования генетической информации. Полнотранскриптомная амплификация одиночных клеток, проводимая с помощью REPLI-g WTA Single Cell Kit, сочетается с соответствующим набором для полногеномной амплификации (REPLI-g Single Cell Kit). Метод основан на технологии MDA, в которой применяется изотермическая амплификация кДНК с использованием уникальной высоко-процессивной ДНК-полимеразы, способной реплицировать до 70 тыс. п.о. без диссоциации с кДНК-матрицей.

Уникальные компоненты набора REPLI-g WTA Single Cell Kit:

  • Все ферменты и реагенты набора подвергаются уникальной контролируемой процедуре деконтаминации, чтобы элиминировать посторонние ДНК и РНК. После этого, наборы проходят строгий контроль качества и проверку всего функционала.
  • Инновационный лизирующий буфер эффективно стабилизирует клеточную РНК. Это обеспечивает высокую сходимость полученной РНК и профиля генной экспрессии in vivo.
  • Все стадии ферментативной обработки были специально разработаны для обеспечения эффективной обработки РНК для повышенной точности амплификации. Например, эти процессы включают количественное удаление геномной ДНК сразу после синтеза кДНК.
  • Новейшая ДНК-полимераза SensiPhi используется для амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA). Это недавно разработанный высокоаффинный фермент, который связывает кДНК более эффективно, особенно когда концентрация кДНК в реакционной смеси невысока. Более того, в отличие от методов, основанных на ПЦР, ДНК-полимераза SensiPhi обладает сильной корректирующей активностью, что приводит к 1000-кратному уменьшению ошибок. Фермент также имеет высокую активность по вытеснению цепи, позволяя реплицировать даже стабильные шпилечные структуры кДНК, которые устойчивы к полногеномным или полнотранскриптомным процедурам амплификации с использованием Taq-полимеразы.

Ход работы

Генетический анализ часто требует больших количеств кДНК. Полнотранскриптомная амплификация преодолевает ограничения, связанные с низким количеством РНК, позволяя анализировать малое количество клеток либо одиночные клетки. Простые и отлаженные этапы постановки и проведения реакции, малое время ручных процедур (20 минут) и общее время реакции для полной амплификации суммарной РНК, равное 4 часам, делают работу с набором REPLI-g WTA Single Cell Kit простым и надежным методом.

Набор REPLI-g WTA Single Cell Kit содержит компоненты для проведения ряда последовательных реакций:

Лизис клеток: образец одиночных клеток (1-1000 клеток) эффективно лизируется в течение 5 минут без потери целостности РНК. Лизированный образец используется для полностранскриптомного анализа суммарной РНК или, как вариант, фракции мРНК-обогащенной РНК (poly A+).

Синтез кДНК: далее, перед амплификацией, геномная ДНК удаляется, так как точность измерений уровня транскриптов зависит от отсева ложноположительных результатов, вызванных контаминацией геномной ДНК. В зависимости от выбранных праймеров для реакции обратной транскрипции, будут амплифицированы либо все транскрипты (при обогащении суммарной РНК с помощью random-праймера и олиго-dT), либо только полиаденилированные транскрипты (при обогащении на мРНК (poly A+) с помощью олиго-dT-нуклеотидов. Соответственно, реакционная смесь будет содержать либо олиго-dT- и random-праймеры, либо только олиго-dT, что уменьшит амплификацию рРНК и обеспечит обратную транскрипцию 3’-конца кДНК (размер транскриптов приблизительно 700-1000 п.н.).

Лигирование: синтезированная кДНК подвергается лигированию с применением высокоэффективной смеси для лигирования. Из-за характера реакции лигирования, фрагменты кДНК не собираются в том же порядке, в котором они были в клетке первоначально. Тем не менее, это не влияет на обнаружение последовательностей нуклеиновых кислот, например, областей сплайсинга, в последующих приложениях, таких как NGS или количественный ПЦР.

Полнотранскриптомная амплификация: лигированная кДНК амплифицируется в изотермической реакции по технологии MDA с помощью новой ДНК-полимеразы SensiPhi в течение 2х часов.

В зависимости от исследовательской задачи, разработаны различные протоколы для амплификации кДНК из одиночных клеток или очищенной РНК:

  • В протоколе «Амплификация 3'-областей мРНК (поли-А+) из одиночных клеток» происходит амплификация только мРНК (и других РНК) с поли-А-последовательностями, что подходит для широкого спектра приложений, включая NGS (РНК-Seq), ПЦР в реальном времени, и биочипового анализ.
  • В протоколе «Амплификация суммарной РНК из одиночных клеток» происходит амплификация всего транскриптома, включая РНК как с поли-A-последовательносттю, так и без нее, а также длинных некодирующих РНК. Следует обратить внимание, что рРНК также вступает в реакцию и будет присутствовать в повышенном количестве после амплификации. При работе с сиквенс-специфическими пробами, такими как количественная ПЦР или биочипы, амплифицированная рРНК не повлияет на результаты последующих приложений. При использовании амплифицированной РНК для РНК-Seq, нужно иметь в виду, что более 90% прочтений будут получены для рРНК.
  • Протокол «Амплификация очищенной РНК» оптимизирован для полнотранскриптомной амплификации суммарной или обогащенной РНК-матрицы и подходят для широкого спектра приложений, включая NGS, ПЦР в реальном времени и биочиповый анализ.

Области применения

Набор реагентов REPLI-g WTA Single Cell Kit позволяет равномерно амплифицировать все транскрипты и точно анализировать профиль транскрипции одиночных клеток с очень низким уровнем ошибок амплификации. В зависимости от протокола амплифицированная кДНК подходит для анализа методами NGS (RNA-Seq), ПЦР в реальном времени или биочиповом анализе.

Набор реагентов REPLI-g WTA Single Cell Kit может быть использован для полнотранскриптомной амплификации для анализа:

  • Поли-А фракции РНК (мРНК)
  • Суммарной РНК 
  • Всех регионов РНК-транскриптов 
  • 3’-концов мРНК 
  • длинных некодирующих РНК (lncRNA, днРНК) 

Набор не подходит для использования с короткими нуклеиновыми кислотами, такими как тРНК и микроРНК.

Подробнее о наборах серии REPLI-g WTA Single Cell на сайте QIAGEN:
https://www.qiagen.com/ru/shop/sample-technologies/rna/rna-preparation/repli-g-wta-single-cell-kit/#productdetails

Дополнительная информация:

  • Product Flyer: REPLI-g Single Cell Kit Скачать
  • Poster: Comparative transcriptome and genome analysis down to the sequence level for individual cells Скачать
  • Product Profile: Get the most from a single cell Скачать

Задать вопрос

   
CAPTCHA
*Введите код с картинки:


* - поля, обязательные для заполнения.