Позвоните нам, если появились вопросы

8-800-100-28-84

(бесплатно для звонков по РФ)

+7 (495) 664-28-84

Анализ генома одиночных клеток

single cell dna

Компанией QIAGEN разработаны наборы реагентов для унифицированной полногеномной амплификации (WGA) из одиночных клеток или образцов с ограниченным количеством материала:

  • Полногеномная амплификация ДНК одиночных клеток с полным покрытием генома
  • Низкий уровень ошибок при амплификации геномных локусов благодаря технологии амплификации с множественным вытеснением цепи (Multiple Displacement Amplification, MDA)
  • Оптимизировано для использования с новыми технологиями, включая NGS
  • Стабильный выход до 40 мкг (средняя длина продукта >10 тыс. п.о.)
  • Новейший инструмент для исследований в области онкологии, изучения стволовых клеток и метагеномики

Анализ последовательности ДНК и генотипирование биологических образцов с использованием инновационных подходов, таких как секвенирование следующего поколения (NGS), часто ограничены малым количеством доступного для анализа материала. Набор REPLI-g Single Cell Kit специально разработан для унификации процедуры амплификации геномной ДНК из одиночных клеток (от 1 до 1000 бактериальных или опухолевых клеток) или очищенной геномной ДНК с полным покрытием. Дополнительные протоколы позволяют использовать образцы свежесобранной или высушенной крови, свежей или замороженной ткани. Предлагаемые буферы и реагенты проходят уникальную, управляемую процедуру деконтаминации для предотвращения амплификации посторонней ДНК, обеспечивая высокую надежность получаемых результатов. Точная амплификация геномов с пренебрежимо малыми ошибками при копировании последовательности и без каких-либо геномных делеций достигается с помощью инновационной технологии амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA). В сравнении с WGA (whole genome amplification) на основе ПЦР, точность репликации увеличена 1000-кратно, что позволяет избежать ложноположительные и ложноотрицательные результаты.

Доступны следующие варианты наборов:

  • REPLI-g Single Cell Kit (24), кат. номер 150343
  • REPLI-g Single Cell Kit (96), кат. номер 150345

Характеристика

Полное покрытие генома, специально для NGS и других приложений

ДНК, амплифицированная с использованием технологии Repli-g Single Cell Kit, имеет среднюю длину более 10 тыс. п.о., что максимизирует покрытие генома. Такие продукты амплификации были проверены для анализа различными методами, включая секвенирование следующего поколения (NGS), сравнительную геномную гибридизацию (aCGH) и ПЦР в режиме реального времени (Таблица 1). Поскольку при ПЦР-амплификации существуют ограничения по продолжительности каждого цикла, полногеномная амплификация Repli-g и подготовка библиотек ДНК требуют меньше времени и приводят к большей длине прочтения, чем методы на основе ПЦР. Высококачественные, воспроизводимые результаты NGS анализа демонстрируют большое покрытие и очень низкую частоту ошибок, что достигаются при использовании как очищенной геномной ДНК, так и ДНК, полученной с помощью набора Repli-g Single Cell, в том числе при анализе единичных бактериальных клеток. Эти результаты также подтверждает комплексное исследование широкого спектра маркеров всех аутосомных хромосом человека и Х-хромосомы, демонстрирующее, что при использовании технологии Repli-g Single Cell успешно амплифицируются все области генома без исключения.

Таблица 1. Типы исходных материалов и области применения.

Материал образца (клетки/ДНК)

Область исследований

Клетки человека, животных

Анализ биомаркеров (SNP, мутации, CNV)

Стволовые клетки

Анализ циркулирующих клеток плода (фетальной ДНК)

Изучение мозаичности

Наследственная предрасположенность

Типирование трансгенных животных

Опухолевые клетки

Анализ соматических мутаций

Механизмы канцерогенеза

Эволюция опухолевых и стволовых клеток

Анализ циркулирующих опухолевых клеток

Бактерии

Метагеномные исследования

Анализ патогенов

Генотипирование микроорганизмов

Растения (клетки без клеточной стенки или очищенная геномная ДНК)

Исследования устьиц

Анализ пыльцы


Преимущества технологии Repli-g Single Cell Kit

Методики WGA на основе ПЦР, широко предлагаемые различными производителями, приводят к образованию коротких фрагментов, ограниченных концевыми последовательностями ПЦР-праймеров, что может повлиять на конечные результаты анализа (например, методом секвенирования следующего поколения). Методики WGA на основе ПЦР могут также привести к размножению ошибок в амплификации, что приводит, например, к появлению точечных мутаций, укорочению или удлинению участков STR локусов, а также приводит к отклонениям представленности локусов в связи с низкой точностью Taq ДНК-полимеразы. В противоположность этому, технология Repli-g Single Cell Kit обеспечивает высокую однородность амплификации всего генома с минимальными отклонениями в процессе пробоподготовки и анализа. В сравнительном исследовании, четыре WGA набора различных производителей – 2 набора с технологией MDA, включая Repli-g Single Cell Kit, 2 ПЦР-набора – были испытаны на точность воспроизведения последовательности и выпадение локусов. В отличие от результатов работы набора Repli-g Single Cell Kit, анализ отдельных клеток наборами других производителей зачастую был неполным и ошибочным.

Принцип действия

Набор REPLI-g Single Cell Kit содержит полимеразу REPLI-g sc, оптимизированную версию высокоточной полимеразы Phi29, для амплификации геномной ДНК по технологии множественного вытеснения цепи (MDA), что вместе с инкубацией в мягких щелочных условиях обеспечивает низкий уровень фрагментации ДНК и уменьшает образование апуриновых сайтов. Набор специально разработан для высокого выхода амплифицированной ДНК из одиночных клеток, таких как изолированные опухолевые или бактериальные клетки. Стандартный выход ДНК стабильно составляет 40 мкг, независимо от исходного количества матрицы, что позволяет проводить последующие этапы генетического анализа без дополнительного измерения концентрации ДНК. Средняя длина продукта ДНК свыше 10 тыс. п.о. и полное покрытие генома гарантирует, что ДНК, амплифицированная набором Repli-g Single Cell Kit, подойдет для многих методов анализа, включая секвенирование следующего поколения (NGS), сравнительную геномную гибридизацию (CGH), пиросеквенирование и ПЦР в режиме реального времени (Таблица 2).

Таблица 2. Области применения и инструментарий.

Применение

Инструментарий

Полногеномное секвенирование

Платформы для NGS

Секвенирование экзома

Генотипирование

Платформы для гибридизации и анализа микрочипов*

Сравнительная геномная гибридизация

ПЦР

Термоциклеры, в т.ч. для детекции в режиме реального времени*

Секвенирование по Сэнгеру

Капиллярные секвенаторы*

Пиросеквенирование

PyroMark (QIAGEN)

Доступно у различных производителей.

Принцип амплификации

В наборе Repli-g Single Cell Kit применяется изотермическая амплификация генома, или амплификация с множественным вытеснением цепи (Multiple Displacement Amplification, MDA), которая заключается в связывании вырожденных гексамеров с денатурированной ДНК с последующим синтезом цепи при постоянной температуре с помощью модифицированной формы полимеразы Phi 29, которая обладает исключительно сильной активностью по вытеснению цепи. Дополнительное праймирование происходит на каждой вытесненной цепи, служащей матрицей, позволяя амплифицировать ДНК с высоким выходом. Полимераза Phi 29, полученная из бактериофага, является ДНК-полимеразой с 3'-5'-экзонуклеазной (корректирующей) активностью, что обеспечивает 1000-кратное повышение точности по сравнению с Taq ДНК-полимеразой. Благодаря уникальной оптимизированной системе REPLI-g Single Cell, полимераза Phi 29 легко проходит структурированные участки ДНК, такие как шпильки и петли, предотвращая скольжение, остановки и диссоциацию полимеразы во время амплификации. Такой подход позволяет синтезировать без ошибок фрагменты ДНК до 100 тыс. п.о.

Лизис клеток и щелочная денатурация ДНК

Геномную ДНК необходимо денатурировать перед амплификацией, для чего часто применяют жесткие методы, такие как инкубация при повышенных температурах или повышенном рН. В протоколе REPLI-g Single Cell Kit используется инкубация при мягких щелочных условиях, что позволяет лизировать клетки и равномерно денатурировать геномную ДНК с очень низкой фрагментацией и без образования АР-сайтов. Это приводит к очень высокой целостности амплифицируемой ДНК, и обеспечивает максимальную длину амплифицированных фрагментов, так что геномные локусы и последовательности представлены равномерно.

Эффективная деконтаминация

Все компоненты набора REPLI-g Single Cell Kit проходят процедуру уникальной деконтаминации для удаления всех потенциально амплифицируемых посторонних примесей ДНК. Буферы и реагенты при производстве обрабатываются УФ-излучением с помощью инновационной и стандартизованной процедуры, которая гарантирует отсутствие примесей посторонней ДНК. После УФ обработки, наборы проходят строгий контроль качества для подтверждения полной функциональности.

Ход работы

Простая процедура в 1 пробирке

В наборе REPLI-g Single Cell Kit применяется простой и надежный способ для высокоточной амплификации генома отдельных клеток или небольших образцов. Простая процедура постановки реакции составляет приблизительно 15 минут. Все компоненты набора были разработаны для обеспечения высокого выхода ДНК из одиночных клеток с полным покрытием генома и безошибочной амплификацией (Таблица 3). ДНК, амплифицированную REPLI-g, можно хранить при -20°C длительное время без каких-либо отрицательных последствий для образца.

Таблица 3. Компоненты набора REPLI-g Single Cell Kit.

Компоненты набора и процедура деконтаминации

Преимущества

REPLI-g sc Полимераза

Протяженные фрагменты до 70 тыс. п.о.

1000-кратное повышение точности по сравнению с Taq ДНК-полимеразой

Полное покрытие последовательности

Однородная амплификация всех локусов

Реакционный буфер**

Оптимизирован для высокоточной амплификации и равномерного покрытия всех локусов

Буфер DLB (лизис и денатурация)

Эффективная подготовка к амплификации

Сохранение ДНК при разрушении других полимеров

Процедура деконтаминации УФ-излучением

Обеспечивает удаление остаточной ДНК постороннего происхождения

** Содержит соли, праймеры и нуклеотиды.

Сферы применения

ДНК, амплифицированная набором REPLI-g Single Cell Kit может быть в дальнейшем использована в проведении различных исследований, в том числе:

  • Секвенирование следующего поколения (NGS)
  • Генотипирование SNP с помощью системы TaqMan
  • Детекция мутаций количественным ПЦР
  • Анализ микросаттелит, STR локусов
  • Секвенирование по Сэнгеру
  • Пиросеквенирование
  • Биочиповый анализ, сравнительная геномная гибридизация (CGH)

Подробнее о наборах серии REPLI-g Single Cell Kit на сайте QIAGEN:

https://www.qiagen.com/ru/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/repli-g-single-cell-kit/#orderinginformation

Дополнительная информация:

  • Scientific article: Genomic analysis of individual cells by NGS and real-time PCR Скачать
  • Scientific Poster: Accurate genome analysis of single cells Скачать
  • Scientific Poster: Comparative transcriptome and genome analysis down to the sequence level for individual cells Скачать
  • Scientific Poster: Targeted Sequencing for Accurate Mutation Detection at the Single-Cell Level Скачать
  • Scientific Poster: The impact of whole genome amplification on forensic testing Скачать
  • Poster: Achieve improved variant detection in single cell sequencing Скачать

Задать вопрос

   
CAPTCHA
*Введите код с картинки:


* - поля, обязательные для заполнения.