Позвоните нам, если появились вопросы

8-800-100-28-84

(бесплатно для звонков по РФ)

+7 (495) 664-28-84

Жидкостная биопсия: система секвенирования NGS GeneReader позволяет выявлять аллельные варианты с чувствительностью 1% в образцах свободно циркулирующей ДНК (цДНК)

NGS решения от образца до результата

QIAGEN является передовой компанией в области жидкостной биопсии. Разработанные решения позволяют лабораториям быстро и точно анализировать свободно циркулирующую ДНК (цДНК) для оценки биомаркеров при проведении онкологических исследований.

Новая система секвенирования следующего поколения GeneReader (NGS) представляет собой первое в мире NGS решение «от Образца до Результата», которое позволяет справиться с ограничениями стандартных NGS решений при внедрении в клинико-практическую практику. Панель GeneRead Actionable Insights Tumor Panel была разработана специально для целевого обогащения наиболее важных генов, позволяя получить клинически значимую информацию при исследовании рака [1]. Дизайн панели позволяет эффективно выявлять клинически значимые варианты, которые обнаруживаются при самых распространенных типах онкологических заболеваний: рак молочной железы, рак яичников, колоректальный рак, рак легких, меланома. Ранее для данной панели и системы GeneReader были показаны стабильно высокие показатели работы при анализе FFPE образцов [1]. В этой работе приведены доказательства того, что панель также надежно позволяет детектировать генетические варианты в образцах плазмы, содержащих фрагменты опухолевой ДНК, с чувствительностью 1%.

Введение

На сегодняшний день молекулярная характеристика рака сфокусирована главным образом на анализе фиксированных в формалине парафинизированных образцов ткани (FFPE). В то время как анализ образцов FFPE хорошо отработан, данный подход часто ограничен в связи с побочными эффектами хирургического вмешательства, доступностью опухолевой ткани и возможностями пациента. Недавние исследования показали, что гетерогенность опухоли является важным фактором при ее поведении, включая ответ или устойчивость к терапии, а также супрессию или рецидив заболевания [2-4]. В последние годы возникла новая область исследований – «жидкостная биопсия», направленная на анализ цДНК, в том числе с использованием технологии NGS. Эти фрагменты ДНК высвобождаются клетками опухоли в кровеносную систему, и результаты генетического анализа такой ДНК могут часто пролить свет на характеристики опухоли и прогрессирование заболевания. Анализ образцов плазмы и жидкостная биопсия позволяют обнаруживать ключевые биомаркеры и в режиме реального времени отслеживать генетические изменения в ходе заболевания [3]. Одним из таких примеров является ген EGFR, в котором были выявлены мутации, определяющие развитие резистентности в различных типах рака [5, 6].

Новое направление анализа, жидкостная биопсия, на сегодняшний день испытывает недостаток готовых решений на основе метода NGS с проверенными показателями работы. Компания QIAGEN уже является ведущим экспертом в области подготовки образцов для жидкостной биопсии. Специализированные наборы реагентов позволяют лаборатории проводить обогащение и очистку цДНК из образцов плазмы в достаточном количестве и качестве для NGS анализа. Новая система секвенирования GeneReader является первым адаптированным решением «от Образца до Результата» для любой исследовательской лаборатории, в том числе, не располагающей достаточными ресурсами, специальными знаниями или не имеющей обширного опыта использования технологии NGS. С разработкой нового протокола жидкостной биопсии для панели GeneRead Actionable Insights Tumor Panel стал доступен мощный инструмент для анализа цДНК при проведении онкологических исследований.

Материалы и методы

В исследовании были использованы коммерчески доступные образцы, которые представляли собой контрольные стандарты цДНК и клинические образцы (плазма крови человека).

Контрольные стандарты «Multiplex I cfDNA Reference Standards» (Horizon, кат. номер HD780) являются источником фрагментированной геномной ДНК человека (или источник образцов цДНК) и содержат клинически значимые варианты с известными величинами аллельных частот, которые были проверены с помощью цифровой ПЦР (ddPCR) [7, 8]. В этом исследовании для подтверждения эффективности работы системы GeneReader для обнаружения вариантов с низкой частотой встречаемости (типичные образцы цДНК) были использованы контрольные стандарты с частотой аллельных вариантов 1% и выше. Перед использованием концентрацию образцов ДНК измеряли флуориметрическим методом.

Препараты ДНК были получены из 16 коммерческих образцов плазмы человека от пациентов с подтвержденным диагнозом немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) с использованием набора реагентов QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (QIAGEN, кат. номер 55114). ДНК была элюирована в объеме 20 мкл для обеспечения максимальной концентрации ДНК. Полученные таким образцом препараты ДНК количественно оценивались флуориметрическим методом. Выход ДНК составил 0,4-2 нг/мкл. Затем был проведен фрагментарный анализ ДНК с помощью капиллярного гель-электрофореза (размер фрагментов цДНК составил в среднем 160 пар оснований).

Полученные образцы ДНК из стандартов «Multiplex I cfDNA Reference Standards» и образцов плазмы были проанализированы на системе GeneReader (рис. 1) в соответствии с готовыми протоколами выполнения анализа (см. более подробную информацию на сайте производителя www.qiagen.com). Панель GeneRead Actionable Insights Tumor Panel была использована для целевого обогащения генов методом ПЦР (QIAGEN, кат. номер 181910), система GeneReader была использована для проведения секвенирования.

Процесс биоинформатического анализа был специально оптимизирован для жидкостной биопсии с использованием панели GeneRead Actionable Insights Tumor Panel и программного обеспечения QIAGEN Clinical Insight (QCI) Analyze, что позволило определить варианты с чувствительностью 1%. Программное обеспечение QCI Interpret было использовано для оценки клинической значимости каждого обнаруженного варианта.

секвенирования следующего поколения GeneReader и этапы рабочего процесса

Рисунок 1. Система секвенирования следующего поколения GeneReader и этапы рабочего процесса.

Результаты и обсуждение

Для оценки возможности системы GeneReader детектировать варианты с чувствительностью 1%, были впервые проанализированы стандарты «Multiplex I cfDNA Reference Standards» с использованием панели GeneRead Actionable Insights Tumor Panel. Результаты проверки оказались успешными и на 100% совпали с данными цифровой ПЦР (табл. 1). Одиночные нуклеотидные варианты (SNV) и индел-мутации (INDEL) были определены с чувствительностью 1%. Многие из этих вариантов, таких как мутация L858R в гене EGFR, оказались значимыми мутациями при НМРЛ [9, 10, 11].

Таблица 1. Сравнительные результаты работы системы секвенирования следующего поколения GeneReader, полученные на экспериментальных образцах и контрольных стандартах «Horizon Multiplex I cfDNA Reference Standard». Экспериментальные данные Set 1 и Set 2 представляют собой образцы, проанализированные в режимах 4-Plex и 6-Plex соответственно.

Сравнительные результаты работы системы секвенирования следующего поколения GeneReader

* ΔE746-A750 – делеция в экзоне 19 (10)
† V769 - D770insASV – инсерция в экзоне 20 (11)

16 образцов плазмы от онкологических пациентов были проанализированы с использованием системы GeneReader и панели GeneRead Actionable Insights Tumor Panel для оценки производительности системы на клинических образцах плазмы. Из 16 проанализированых образцов, для семи было показано наличие мутаций в гене EGFR (L858R и делеции в экзоне 19) (табл. 2). Кроме того, эти мутации были подтверждены с использованием метода ПЦР (в частности, был использован набор therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit (QIAGEN, кат. номер 870311)).

Полученные данные свидетельствуют о высокой точности анализа как контрольных стандартов цДНК, так и клинических образцов плазмы. Это первое проведенное исследование такого рода с представлением данных по точности технологии анализа жидкостной биопсии в сочетании с полностью интегрированной системой NGS.

Важно отметить, что используемый метод для подготовки нуклеиновых кислот и качество анализируемого образца оказывают существенное влияние на качество данных секвенирования. Компания QIAGEN предлагает следующие действия для получения оптимальных результатов исследования:

  • Оптимальное выделение цДНК из образцов плазмы может быть достигнуто путем забора крови в специализированные пробирки, которые обеспечивают эффективную стабилизацию образцов для жидкостной биопсии.
  • Анализ выделенной ДНК с применением капиллярного гель-электрофореза для проверки загрязнения образца высокомолекулярной ДНК, которая может повлиять на результаты запуска секвенатора (например, с QIAGEN QIAxcel Advanced, кат. номер 9001941).
  • Выделение ДНК из 4-5 мл плазмы с минимальным объемом элюции по протоколу QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit поможет максимизировать выход ДНК из образцов плазмы. Низкий выход ДНК может препятствовать обнаружению низких частот вариантов. Рекомендуемая концентрация образцов ДНК для NGS анализа составляет 1 нг/мкл и выше. Более низкие концентрации ДНК могут быть использованы, но это не гарантирует получение качественных результатов секвенирования.

Таблица 2. Показатели работы системы GeneReader на коммерческих образцах плазмы человека (от онкологических пациентов). Копии вариантов вычисляются исходя и предположения, что 1 нг цДНК эквивалентен 360 геномным эквивалентам. Для сравнения, результаты анализа контрольных образцов «Horizon Multiplex I cfDNA Reference Standards», изначально разведенных до концентрации 1 нг/мкл, показаны для вариантов ΔE746 - A750 и L858R.

работы системы GeneReader на коммерческих образцах плазмы человека

Заключение

По мере роста наших знаний о механизмах возникновения и развития онкологических заболеваний, возникает все большая потребность в мониторинге мутационного ландшафта опухолей в режиме реального времени. Было показано, что мониторинг развития лекарственной устойчивости опухоли на основании результатов анализа молекулярных маркеров, является эффективной тактикой для получения более глубокого понимания развития этой болезни. Жидкостная биопсия потенциально является эффективным инструментом для обеспечения непрерывного мониторинга статуса опухоли, в то время как классическая биопсия в состоянии дать ответ только на момент забора материала. Таким образом, технология жидкостной биопсии совместно с правильным решением для секвенирования может раскрыть весь свой потенциал, и предоставить доступ к ранее недоступной информации.

Представленные данные демонстрируют стабильно высокие показатели работы системы GeneReader для контрольных образцов и экспериментальных образцов плазмы. Таким образом, применяя технологии выделения и очистки цДНК QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, секвенирования GeneReader и панели GeneRead Actionable Insights Tumor Panel, была продемонстрирована возможность надежного обнаружения ключевых генетических вариантов в гене EGFR с частотой 1%. Кроме того, эти мутации были подтверждены независимым методом ПЦР (в частности, therascreen EGFR Plasma RGQ). Используя описанный рабочий процесс, научно-исследовательские лаборатории теперь могут анализировать образцы цДНК с высокой точностью с помощью полного и единого NGS решения.

Таким образом, система секвенирования следующего поколения GeneReader обладает следующими преимуществами при проведении жидкостной биопсии:

  • Специфическое и эффективное обогащение цДНК с высоким качеством и выходом;
  • Проверенный протокол исследования, созданный специально для жидкостной биопсии и обеспечивающий высокие показатели чувствительности и специфичности;
  • Высокие показатели работы и уверенность в полученных результатах секвенирования и интерпретации.

Система секвенирования следующего поколения GeneReader является единственным полностью готовым NGS решением от образца до результата. Теперь, с валидированным протоколом для проведения жидкостной биопсии, система GeneReader станет эффективным инструментом анализа для любой лаборатории, заинтересованной в проведении онкологических исследований.

Список литературы:

1. Oncology insights enabled by knowledge base-guided panel design and the seamless workflow of the GeneReader NGS System. Qiagen, 2015.

2. Brouwer A, De Laere B, Peeters D, Peeters M, Salgado R, Diriz L, Can Leare S. Evaluation and consequences of heterogeneity in the circulating tumor cell component. Oncotarget. 2016; Epub ahead of print.

3. Quin Z, Ljubimov VA, Zhou C, Tong Y, Liang J. Cell-free circulating tumor DNA in cancer. Chin J Cancer. 2016; 35:36.

4. Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, Biggs H, Rueda OM, Chin SF, et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med. 2013;368(13):1199–1209.

5. Alix-Panabieres C, Pantel K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov. 2016; 6(5):479-91.

6. Braig F, Voigtlaender M, Schieferdecker A, Busch CJ, Laban S, Grob T et al. Liquid biopsy monitoring uncovers acquired RAS-mediated resistance to cetuximab in a substantial proportion of patients with head and neck squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016; Epub ahead of print.

7. Devonshire A, Fernandez-Gonzalez A, Whale A, Ng, SWJ, Amit H, et al. Independent study of Horizon Dx Cell Free DNA Reference Standards demonstrates strong concordance in the assessment of key material parameters. Horizon Discovery, Technical Note.

8. cfDNA Product Specification Sheet 6068 PSS-01 (V-01) for cfDNA Reference Standard Set, Horizon Discovery.

9. Morrow CJ, Trapani F, Metcalf RL, Bertolini G, Hodgkinson CL, Khandelwal G et al. Tumorigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumor cells: a clinical case study. Ann Oncol. 2016; Epub ahead of print.

10. Corominas-Faja B, Oliveras-Ferraros C, Cuyas E, Segura-Carretero A, Joven J et al. Stem cell-like ALDH bright cellular states in EGFR mutant non-small cell lung cancer. Cell Cycle. 2013; 12(21):3390-3404.

11. Oxnard GR, Lo P, Nishino M, Dahlberg S, Lindeman, NI, et al. Natural history and molecular characteristics of lung cancers harboring EGFR exon 20 insertions. J Thorac Oncol, 2013; 8(2):179-184.

Дополнительная информация:

Задать вопрос

   
CAPTCHA
*Введите код с картинки:


* - поля, обязательные для заполнения.